關(guān)鍵詞:Southern Blot|實驗技術(shù)服務(wù)
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Southern Blot|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
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產(chǎn)品品牌：Southern Blot|實驗技術(shù)服務(wù)   http://handsem.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 一、 待測核酸樣品的制備
(一)制備待測DNA
基因組DNA是從動物組織(或)細(xì)胞制備。1.采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑裂解細(xì)胞，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細(xì)胞;2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA;3.用有機試劑(酚/氯仿)抽提方法去除蛋白質(zhì)。
(二) DNA限制酶消化
基因組DNA很長，需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析，通常用限制酶消化DNA。一般選擇一種限制酶來切割DNA分子，但有時為了某些特殊的目的，分別用不同的限制酶消化基因組DNA。切割DNA的條件可根據(jù)不同目的設(shè)定，有時可采用部分和充分消化相結(jié)合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活限制酶,樣品即可直接進行電泳分離，必要時可進行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進行電泳分離。
二、 瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品
(一)基本原理
Southern印跡雜交是先將DNA樣品(含不同大小的DNA片段)先按片段長短進行分離，然后進行雜交。這樣可確定雜交靶分子的大小。因此，制備DNA樣品后需要進行電泳分離。在恒定電壓下，將DNA樣品放在0.8~1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳可分辨70-80000bp的DNA片段，故可對DNA片段進行分離。但需要用不同的膠濃度來分辨這個范圍內(nèi)的不同的DNA片段。原則是分辨大片段的DNA需要用濃度較低的膠，分辨小片段的DNA則需要濃度較高的膠。經(jīng)過一段時間電泳后，DNA按分子量大小在凝膠中形成許多條帶，大小相同的分子處于同一條帶位置。另外為了便于測定待測DNA分子量的大小或是所處的分子大小范圍，往往同時在樣品鄰近的泳道中加入已知分子量的DNA樣品即標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA (DNA marker)進行電泳。DNA marker可以用放射性核素進行末端標(biāo)記，通過這種方式，雜交后的標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA也能顯影出條帶。
(二) 基本步驟
1. 制備瓊脂糖凝膠，盡可能薄。DNA樣品與上樣緩沖液混勻，上樣。推薦使用的靶基因的上樣量見不同條件下上樣本的使用指針比較表。一般而言，對雜交系統(tǒng)，所需DNA樣品的濃度較低，每道加2.5-5μg人類基因組DNA;如果基因組比人類DNA更復(fù)雜(如植物DNA)則上樣量可達(dá)10μg;每道上質(zhì)粒DNA<1ng。
2. 分子質(zhì)量標(biāo)志物(DIG標(biāo)記)上樣。
3. 電泳，使DNA條帶很好的分離。不同條件下上樣本的使用指針比較表
不同條件下上樣本的使用指針比較表
4. 評價靶DNA的質(zhì)量。在電泳結(jié)束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min，紫外燈下觀察凝膠。