關(guān)鍵詞:Northern Blot技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
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Northern Blot技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧，承諾客戶不成功不收費。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時，我們也會提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費精力重復(fù)實驗。另一方面，我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信，我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復(fù)我們的實驗結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：Northern Blot技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)   http://handsem.com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 一、 試劑準備
1.  0.5M EDTA：EDTA 16.61g加ddH2 O至80ml，調(diào)pH至8.0，定容至100ml。
2． 50mM NaAc：NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml，加DEPC 0.5ml，振蕩，37℃高壓滅菌。
3． 5×甲醛凝膠電泳緩沖液：MOPS [3-(N-瑪琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml，用2N NaOH調(diào)pH至7.0，再加入0.5M EDTA 10ml，加DEPC H2O至500ml。無菌抽濾，室溫避光保存。
4． 20×SSC：NaCl 175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加ddH2O至800ml，用2N NaOH調(diào)pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC處理、高壓滅菌。
5. 6×SSC：20×SSC 300ml加ddH2O至1000ml。DEPC處理,高壓滅菌。
6．50×Denhardt：聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml，無菌抽濾、分裝。
7．1M Na2HPO4：Na2HPO4-12H2O 35.81g，加dd H2O至100ml。
8. 1M NaH2PO4： NaH2PO4-2H2O 15.6g， 加dd H2O至100ml。
9. 0.1M 磷酸鈉緩沖液(pH 6.6)：Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
10.STE緩沖液：1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml，0.5M EDTA，0.5ml，5M NaCl 5ml，加dd H2O至250ml。
11.預(yù)雜交液：20×SSC 5ml，甲酰胺10ml，50×Denhardt 4ml，1M磷酸鈉緩沖液0.2ml（pH6.6），10%SDS 1ml，總體積 20ml。臨用前加入變性鮭魚精DNA（10mg/ml），使終濃度為4μl/ml。
12. DEPC H2O：1000mldd H2O中加入DEPC 1ml，充分振蕩，37℃高壓滅菌。
二、操作步驟
1. 總RNA提取。
2.  變性膠的制備：取瓊脂糖0.2g，加入DEPC H2O 12.4ml，加熱熔化，于保溫狀態(tài)下加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混勻、制膠。待膠凝固后，置1×甲醛凝膠電泳緩沖液中預(yù)電泳5min。
3. 樣品制備：取總RNA4.5μl(約20-30μg) ，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液 4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃溫育15min、冰浴5min。加入EB（1μg/μl）1μl、上樣緩沖液2μl。
4. 電泳：上樣，50V電泳（電泳時間約2hr左右）。電泳結(jié)束后將膠塊置紫外燈下，觀察RNA的完整性，記錄18S、28S條帶的位置（離加樣孔的距離）。
5.  將RNA從變性膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜：
① 按膠塊大小剪取膜一張，用DEPC水中浸濕后，置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。將膠塊切去一角，并在20×SSC浸泡15min×2次。
② 用長和寬均大于凝膠的一塊有機玻璃板作為平臺，將其放入大的干烤皿上，上面放一張Whatman 3MM濾紙，倒入20×SSC使液面略低于平臺表面，當平臺上方的3MM濾紙濕透后，用玻棒趕出所有氣泡。
③ 將凝膠翻轉(zhuǎn)后置于平臺上濕潤的3MM濾紙中央，3MM濾紙和凝膠之間不能滯留氣泡。
④ 用Parafilm膜圍繞凝膠四周，以此作為屏障，阻止液體自液池直接流至膠上方的紙巾。
⑤ 在凝膠上方放置預(yù)先已浸濕的尼龍膜，排除膜與凝膠之間的氣泡。
⑥ 將二張已濕潤的、與凝膠大小相同的3MM濾紙置于膜的上方，排除濾紙與濾膜之間的氣泡。
⑦將一疊（5-8cm厚）略小于3MM濾紙的紙巾置于3MM濾紙的上方，并在紙巾上方放一塊玻璃，然后用一個重約500克的重物壓在玻璃板上。其目的是建立液體自液池經(jīng)凝膠向膜上行流路，以洗脫凝膠中的RNA并使其聚集在膜上。
6.使上述RNA轉(zhuǎn)移持續(xù)進行15hr左右。在轉(zhuǎn)膜過程中，當紙巾浸濕后，應(yīng)更換新的紙巾。
7.轉(zhuǎn)移結(jié)束后，揭去凝膠上方的紙巾和3MM濾紙。將膜在6×SSC中浸泡5 min，以去除膜上殘留的凝膠。
8.將凝膠置紫外燈下，觀察膠塊上有無殘留的RNA。
9.膜置80℃，真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 10. 探針標記(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司)：
① 取模板DNA 25ng于0.5ml離心管中，95-100℃變性5min，冰浴5min。
② dNTPmix的制備: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混勻。
③ 將下列反應(yīng)成份混合，加入上述微量離心管中：
dNTPmix           2.0μl
BSA(10mg/ml )     2.0μl
5×buffer        10.0μl
Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
α-32P-dCTP        5.0μl
加入適量dd H2O使反應(yīng)總體積達50μl，輕輕混勻。室溫下反應(yīng)1hr。
11. 預(yù)雜交：將膜的反面緊貼雜交瓶，加入預(yù)雜交液5ml，42℃預(yù)雜交3hr。
12. 雜交：將變性的探針（95-100℃變性5min，冰浴5min）加入到預(yù)雜交液中，42℃雜交16hr。
13. 洗膜：
① 傾去雜交液。
② 2×SSC/0.1%SDS室溫洗15min。
③ 0.2×SSC/0.1%SDS，55℃洗15min×2次。
14.壓片：將膜用dd H2O漂洗片刻，用濾紙吸去膜上水份。用薄型塑料紙將膜包好，置于暗盒中，在暗室中壓上X光片。暗盒置-70℃放射自顯影3～7天左右。
注意事項：
操作應(yīng)該小心，但不必緊張。用于RNA電泳、轉(zhuǎn)膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse 酶，以免樣品的降解。轉(zhuǎn)膜時，注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡。Northern blot 的優(yōu)勢在于它可檢測目的片段的大小、是否具有可變剪切出現(xiàn)、可允許探針的部分不配對性，雜交過后的膜經(jīng)過一定的處理除去探針后還可保存很長時間再次雜交使用。